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非小細(xì)胞肺癌患者外周血DC亞型與 NK細(xì)胞的關(guān)系論文
【摘要】 目的 探討非小細(xì)胞肺癌患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞亞群（dc1/dc2）和機(jī)體nk細(xì)胞含量之間的關(guān)系及其臨床意義。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)40例肺癌患者外周血dc亞群（cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc／dc2）、nk細(xì)胞含量及血漿il12的濃度， 并以10例健康受試者作為對(duì)照。結(jié)果 肺癌患者外周血cd11c+dc百分率為（0.66±0.24）％，比對(duì)照組（1.38±0.18）％明顯降低（p<0.01），cd123+ dc百分率（0.28±0.17）％與對(duì)照組（0.27±0.11）％相比， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；肺癌患者與健康人比較，nk細(xì)胞含量及il12的濃度均降低（p<0.05）。nsclc 患者nk細(xì)胞的含量與cd11c+百分?jǐn)?shù)及血漿il12 濃度均呈正相關(guān)（p<0.05），與cd123+百分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)（p<0.01）。dc各亞型百分率同患者的卡氏評(píng)分、化療史有關(guān)聯(lián)（p<0.01），nk細(xì)胞的含量與年齡相關(guān)（p<0.05）。結(jié)論 非小細(xì)胞肺癌患者dc1功能低下，il12分泌能力障礙，從而影響了nk細(xì)胞的活性。dc亞型與nk細(xì)胞含量之間以及它們與臨床生物學(xué)行為之間都有一定關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】 肺癌 樹(shù)突狀細(xì)胞亞群 自然殺傷細(xì)胞
樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，dc）是一種專(zhuān)職的抗原提呈細(xì)胞， 依據(jù) dc起源和功能，將人外周血 dc 分為兩個(gè)亞群[14]。www.133229.CoM自然殺傷（nature killer，nk）細(xì)胞在機(jī)體免疫中地位重要，外周血nk細(xì)胞的變化是反映機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[5]。晚期非小細(xì)胞肺癌患者dc亞群的表達(dá)水平如何，它同患者機(jī)體nk細(xì)胞的關(guān)系如何，以及此二者同步檢測(cè)的臨床意義究竟如何，目前尚無(wú)定論。本研究對(duì)40例晚期非小細(xì)胞肺癌患者的dc亞群和機(jī)體免疫狀態(tài)進(jìn)行了同步檢測(cè)和分析，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。
1 資料與方法
1.1 病例選擇
收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的非小細(xì)胞肺癌患者40例，對(duì)照組10例，均為健康受試者。
1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）有明確病理診斷的iii～iv期非小細(xì)胞肺癌患者；（2）心、肝、腎和造血系統(tǒng)功能基本正常；（3）預(yù)計(jì)生存期在6個(gè)月以上；（4）karnofsky評(píng)分≥60分。
1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）無(wú)明確病理診斷者；（2）預(yù)期生存期<6個(gè)月者；（3）合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病；（4）兒童、孕婦和精神病患者。
1.2 一般資料
按照上述條件共納入40名患者，均為我科2006年8月～2006年12月期間的住院病人。其中男27例，女13例；年齡38～82歲，中位年齡63歲； iii期15例，iv期25例；病理類(lèi)型：腺癌23例，鱗癌17例。
1.3 試劑與儀器
免疫熒光三標(biāo)記 dc 檢測(cè)試劑盒（3瞔olor dendritic value bundle）購(gòu)自美國(guó) becton dickson 公司，內(nèi)有fitc標(biāo)記的 lineage cocktail 1 （lin1），由cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56系列抗原混合單抗組成， cd11c瞤e、cd123（抗il3r）pe，抗hla瞕r瞤ercp及 陰 性 同 型 對(duì)照小鼠igg1瞤e/igg2瞤e；fitc或pe標(biāo)記鼠抗人cd3-并cd16/cd56+單克隆抗體，facs calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó) becton dickson公司生產(chǎn)），離心機(jī)等。
1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法
1.4.1 外周血 dc1/dc2 亞型的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[6]，取肝素抗凝外周血500μl，分裝4管， 每管100μl全血， 加入lin1、抗hla瞕r瞤ercp、cd123（抗il3r）pe、cd11c瞤e及陰性對(duì)照igg1瞤e/igg2瞤e單抗，振蕩混勻，室溫暗處反應(yīng)15min，加入2ml溶血素，混勻、裂解10min，離心棄上清，洗滌1次，加入300μl的１％多聚甲醛溶液，用facs calibur流式細(xì)胞儀每管收集50000個(gè)細(xì)胞，fsc設(shè)閾值，排除碎片干擾，用cell quest 軟件獲取及分析hla瞕r／lin1點(diǎn)圖中的hla瞕r陽(yáng)性、lin 1弱陽(yáng)性和陰性的細(xì)胞群體，以cd11c和cd123熒光抗體染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率記錄結(jié)果。
1.4.2 nk細(xì)胞的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[7]，用fitc或pe標(biāo)記鼠抗人cd3-并cd16/cd56+單克隆抗體，由流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血中nk細(xì)胞含量。
1.4.3 血漿il12濃度檢測(cè) 按照il12試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行： 于96孔酶標(biāo)板中每孔加入assay diluent rdif 50μl，各孔中分別加入已配制的il12標(biāo)準(zhǔn)液或已經(jīng)室溫融化并離心的血漿樣本200μl，室溫靜置2h，棄上清液并用washer buffer洗滌3次，各孔中加入200μl il12結(jié)合物，室溫靜置2h，棄上清液并用washer buffer洗滌3次，加入200μ1底物溶液，室溫避光靜置20min，加入50μl終止液，靜置25min后上酶標(biāo)儀(450nm)讀取od值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并求出各標(biāo)本的血漿il12濃度。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
應(yīng)用spss13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用兩樣本均數(shù)差別的秩和檢驗(yàn)、雙變量相關(guān)分析及偏相關(guān)分析。
2 結(jié)果
2.1 外周血中樹(shù)突狀細(xì)胞亞型的檢測(cè)
肺癌患者外周血髓系樹(shù)突狀細(xì)胞（mdc，cd11c+）的表達(dá)與正常對(duì)照組比較顯著降低（p<0.01），淋巴系樹(shù)突狀細(xì)胞(ldc，cd123+)的表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），見(jiàn)圖1、表1。表1 肺癌患者與健康對(duì)照組外周血樹(shù)突狀細(xì)胞亞型的檢測(cè)結(jié)果
2.2 外周血中nk細(xì)胞活性及血漿il12濃度的檢測(cè)
檢測(cè)結(jié)果顯示，nsclc 患者血漿il12 濃度為（3.19±0.30）pg/ml， 顯著低于正常人（8.21±1.80）pg/ml (p=0.000)。nsclc患者與健康人比較，nk細(xì)胞的殺傷能力減弱，其含量為（15.51±2.15）％，低于健康對(duì)照組的（22.53±15.25）％（p=0.018），見(jiàn)圖2、表2。
2.3 nsclc患者樹(shù)突狀細(xì)胞亞型、il12及nk細(xì)胞的含量之間相關(guān)性分析
對(duì)nsclc患者外周血中cd11c+、cd123+百
在fsc vs ssc散點(diǎn)圖中劃出單個(gè)核細(xì)胞區(qū)r1，然后將lin1表達(dá)陰性細(xì)胞設(shè)為r2（排除t、b、nk等細(xì)胞），再將hla-dr+cd11c+或hla-dr+cd123+設(shè)為r3（mdc或pdc）
圖1 dc亞型流式細(xì)胞圖
在fsc vs ssc散點(diǎn)圖中劃出淋巴細(xì)胞區(qū)r1，其中cd3-/cd16＋cd56+者即為nk細(xì)胞
圖2 nk細(xì)胞流式細(xì)胞圖
分?jǐn)?shù)與il12、nk細(xì)胞的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，nsclc 患者血漿il12 濃度同cd11c+百分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)（p<0.05）；nk細(xì)胞的含量與cd11c+百分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)（p<0.05），而與cd123+百分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)（p<0.01）。而nsclc 患者血漿il12 濃度同nk細(xì)胞的含量之間亦有關(guān)聯(lián)性，即兩者呈正相關(guān)（p<0.01）。表2 肺癌患者與健康對(duì)照組外周血中 nk細(xì)胞含量及t細(xì)胞亞群的檢測(cè)結(jié)果表3 40例肺癌患者樹(shù)突狀細(xì)胞亞型與外周血il12、nk細(xì)胞含量之間的相關(guān)性表4 40例肺癌患者樹(shù)突狀細(xì)胞亞型與臨床病理特征的關(guān)系
2.4 肺癌患者樹(shù)突狀細(xì)胞亞型、nk細(xì)胞含量與臨床病理特征分析的關(guān)系
肺癌患者樹(shù)突狀細(xì)胞亞型、nk細(xì)胞含量與臨床病理特征的關(guān)系，見(jiàn)表4。按照卡氏評(píng)分（<80vs≥80）、化療史（有vs無(wú)）分組，cd11c+dc百分?jǐn)?shù)有極其顯著性差異（p<0.01），cd123+dc百分?jǐn)?shù)有顯著性差異（p<0.05）；按照病理類(lèi)型（腺癌vs鱗癌）分組cd11c+dc百分?jǐn)?shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；其余分組（性別、年齡、臨床分期）之間的各dc亞型百分?jǐn)?shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而nk細(xì)胞的含量?jī)H與年齡相關(guān)（p<0.05），同其他臨床特征無(wú)明顯關(guān)聯(lián)（p>0.05）。
3 討論
3.1 肺癌患者dc亞型的特征
樹(shù)突狀細(xì)胞（dc）是一種專(zhuān)職的抗原提呈細(xì)胞， 依據(jù) dc起源和功能，將人外周血 dc 分為兩個(gè)亞群：dc1亞群為髓樣細(xì)胞來(lái)源（myeloid dc），它以 cd11c+dc 前體形式存在于外周血中，在炎癥刺激時(shí)分化為成熟的 cd11c+ dc， 產(chǎn)生白細(xì)胞介素il12， 促進(jìn) th1 應(yīng)答； dc2亞群為淋巴樣細(xì)胞來(lái)源（lymphoid dc）， 由其 cd123+dc 前體細(xì)胞加 il3 誘導(dǎo)后分化為成熟的淋巴樣 dc，不產(chǎn)生 il12，誘導(dǎo) th2 應(yīng)答。新鮮分離的外周血 dc 缺乏樹(shù)枝狀的形態(tài)學(xué)特征，其表面均弱表達(dá)或不表達(dá)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及天然殺傷細(xì)胞的標(biāo)記抗原， 但高表達(dá)hla瞕r 抗原。因此，將 淋 巴 細(xì) 胞 系 列 抗 原 （lin1：cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56的混合體） 表達(dá)陰性或弱陽(yáng)性，hla瞕r表達(dá)陽(yáng)性來(lái)初步界定dc群， 再根據(jù) cd11c 和 cd123的表達(dá)來(lái)確定分別為 cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc/dc2。
本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：肺癌患者外周血cd11c+dc/dc1在白細(xì)胞中所占比例低于正常人（p=0.000），而cd123+ dc/dc2在白細(xì)胞中所占比例與正常人無(wú)顯著差異（p=0.829），且cd11c+dc/dc1在數(shù)量上比cd123+ dc/dc2占優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明肺癌患者dc遞呈抗原水平低于正常人，提示肺癌患者機(jī)體免疫功能受損，難以促使未成熟dc向mdc分化，不能有效地通過(guò)細(xì)胞免疫途徑殺傷體內(nèi)的肺癌細(xì)胞；而ldc無(wú)明顯增多，即th2型反應(yīng)無(wú)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明體內(nèi)針對(duì)肺癌細(xì)胞的體液免疫應(yīng)答無(wú)明顯增強(qiáng)。
3.2 肺癌患者dc亞型與nk細(xì)胞的關(guān)系
樹(shù)突狀細(xì)胞（dc）和自然殺傷（nk）細(xì)胞是自身免疫系統(tǒng)的兩種獨(dú)特成分，在免疫調(diào)節(jié)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的建立過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。nk細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞毒性效應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子起作用，而dc則識(shí)別病原體并向適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)出警報(bào)。nk細(xì)胞是自體免疫系統(tǒng)中主要的淋巴細(xì)胞，通過(guò)其細(xì)胞因子產(chǎn)物溶解細(xì)胞，在免疫監(jiān)視、免疫防御中起著十分重要的作用，具有體外殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。
研究表明，dc瞡k細(xì)胞相互作用可導(dǎo)致細(xì)胞激活、成熟甚至死亡。fernandez等[8]的早期研究通過(guò)證明dc激活nk細(xì)胞抗腫瘤活性，首先證實(shí)了體內(nèi)dc瞡k細(xì)胞的相互作用。體外研究表明，nk細(xì)胞和成熟dc的接觸導(dǎo)致兩種細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括nk細(xì)胞增殖和dc成熟[911]。dc可以通過(guò)各種機(jī)制提高nk細(xì)胞的生存率，增加nk細(xì)胞活性和分化。其中重要的機(jī)制之一就是dc分泌的細(xì)胞因子，如il12。il12曾一度被稱(chēng)為自然殺傷細(xì)胞刺激因子或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞分化因子，人體內(nèi)的dc1可通過(guò)分泌il12，促進(jìn)thl反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，而il12又可促進(jìn)dc1的分化、成熟。事實(shí)上，人體內(nèi)的dc能更好地支持nk細(xì)胞的存活[12]。成熟的dc還是il12的主要來(lái)源，il12可以增加nk細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和ifn撥貌生[13]。
本研究結(jié)果顯示nsclc患者外周血mdc含量及血漿il12降低，說(shuō)明nsclc狀態(tài)下外周血mdc存在il12分泌能力的障礙，從而影響了nk細(xì)胞的活性。提示nsclc患者體內(nèi)不僅存在mdc數(shù)量的減少，而且存在nk細(xì)胞功能上的缺陷。nsclc患者體內(nèi)dc產(chǎn)生和功能上的缺陷是腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體監(jiān)視的重要機(jī)制之一。另外，檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著cd123+ dc/dc2的百分含量下降，肺癌患者nk細(xì)胞含量增高（p=0.018），兩者呈顯著負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)證實(shí)，dc瞡k之間的相互作用和通訊，構(gòu)成了一個(gè)正反饋環(huán)路，一旦2種細(xì)胞中的任何一種細(xì)胞感受到了“危險(xiǎn)”或組織損傷發(fā)生，這一環(huán)路將被激活。dc瞡k細(xì)胞之間的相互作用是接觸依賴(lài)型的，但也同時(shí)包括細(xì)胞因子之間的交互作用。
3.3 dc亞型與nk細(xì)胞之間關(guān)系分析的臨床意義
由此可見(jiàn)，dc亞型分布情況、nk細(xì)胞含量在判斷非小細(xì)胞肺癌患者病情發(fā)展上有一定的臨床意義，它們同卡氏評(píng)分、是否化療等臨床特征之間均有十分密切的關(guān)系。所以，當(dāng)肺癌發(fā)生時(shí)，宿主的dc亞群及nk細(xì)胞的功能低下、比例失調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡失調(diào)。
隨著腫瘤患者病情的發(fā)展，腫瘤某些生物學(xué)特征（機(jī)體免疫狀態(tài)和其他一些生物學(xué)指標(biāo)等）同時(shí)發(fā)生一些變化，進(jìn)而提示這些指標(biāo)之間有一定的相關(guān)性。本組研究表明，晚期非小細(xì)胞肺癌患者在接受化療過(guò)程中，隨著卡氏評(píng)分的逐漸降低，機(jī)體免疫功能逐漸下降，與此同時(shí)，dc各亞型的百分比也明顯下降；提示肺癌患者外周血dc亞型與機(jī)體免疫狀態(tài)之間有一種間接的相關(guān)性。
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