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彩超在小鼠原位肝癌移植模型中的應(yīng)用研究
摘要：
目的：
研究應(yīng)用彩超評(píng)價(jià)小鼠原位肝癌移植造模成功的可行性。方法：建立小鼠肝癌原位移植模型， 應(yīng)用彩超方法觀察(3、5、9、16d)不同造模時(shí)間小鼠肝癌原位移植造模情況，同時(shí)與解剖觀察腫瘤比較；并取 其腫瘤作病理組織學(xué)檢查。結(jié)果：彩超在模型建立中后期9d組腫瘤的檢測(cè)結(jié)果與解剖觀察情況相近，腫瘤檢出率 可達(dá)90％。結(jié)論：彩超檢測(cè)方法是一種無(wú)創(chuàng)診斷，可用于小鼠原位肝癌模型的實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)，為建立小鼠原位移植肝癌 模型的判定提供科學(xué)依據(jù).畢業(yè)論文m.stanzs.com
關(guān)鍵詞：彩超；小鼠原位肝癌；模型
目前，肝癌治療措施強(qiáng)調(diào)實(shí)行綜合治療，即通過(guò) 西醫(yī)、中醫(yī)及其他有效的手段和方法相結(jié)合的綜合 治療。中醫(yī)藥在防治肝癌發(fā)生，減少?gòu)?fù)發(fā)，減輕放、 化療的毒副作用，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期等方面 有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，隨著醫(yī)藥科技的發(fā)展，中醫(yī)藥治療肝 癌的臨床療效不斷提高，并且也從多方面展開(kāi)藥物 作用機(jī)理的研究。本文開(kāi)展應(yīng)用現(xiàn)代臨床醫(yī)療的彩 超技術(shù)評(píng)價(jià)小鼠肝癌原位移植模型，試圖為中醫(yī)藥 臨床防治肝癌藥物的藥效實(shí)驗(yàn)研究提供研究手段及 其新的評(píng)價(jià)方法。本研究也是國(guó)家自然基金項(xiàng)目中 藥復(fù)方靶向給藥系統(tǒng)研究的一部分.
材料與方法
1．實(shí)驗(yàn)材料小鼠H22肝癌瘤株：中國(guó)協(xié)和藥 物所提供；清潔級(jí)ICR／b鼠，雄性，6—8周齡，體質(zhì)量 18—229：由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證 號(hào)10—1023；BCN一1 360超凈1=作臺(tái)Jouan公司；KX一41 倒置生物旺微鏡，日本OLYMPUS生產(chǎn)；IU22彩超機(jī)， Phllips公司.
2．實(shí)驗(yàn)方法
2．1小鼠原位肝癌模型的建立及分組取腹腔 接種H22肝癌細(xì)胞株后7d的昆明種小鼠。無(wú)菌抽取H22 肝癌細(xì)胞株腹水，生理鹽水洗滌，離一31 000 r／rain，5min 棄上清，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，生理鹽水調(diào)整癌細(xì)胞數(shù)至 1×108／ml備用。健康昆明種小鼠，戊巴比妥鈉腹腔注 射麻醉，小鼠仰臥固定，備皮，常規(guī)消毒鋪巾，于上腹正 中劍突下作一約Icm的切口。輕壓雙側(cè)肋弓以擠出部分肝葉，濕紗布?jí)|于肝葉下方以保護(hù)’然后用0．25ml醫(yī) 用注射器針頭沿肝葉長(zhǎng)軸方向插人緩慢注入H22肝 癌細(xì)胞懸液0．03ml(細(xì)胞數(shù)為3×106)。在拔出針頭的 同時(shí)，迅速用棉簽輕壓lmin止血，然后在針眼周嗣用 酒精棉球輕搽。小心地將肝臟網(wǎng)納入腹腔，縫合切口， 術(shù)畢【lI。術(shù)后正常飲水、進(jìn)食。術(shù)后將造模動(dòng)物隨機(jī)4 組，即模型3d組，模型5d組，模型9d組，模型16d組， 另設(shè)正常對(duì)照組。正常組動(dòng)物同樣手術(shù)方法給予生 理鹽水造模.
2．2彩超對(duì)小鼠肝癌造模的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分4 次進(jìn)行B超檢測(cè)，每次取5只正常組進(jìn)行對(duì)照，分別于 造模第3、5、9、16H將正常對(duì)照組和模型組小鼠腹部 剪毛處理，用彩超儀對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行掃描，選擇最 適宜條件。彩超檢測(cè)條件：深度：2．0，增益指數(shù)74％， 探頭頻率7．5—12MHz。隨后，脫椎處死小鼠，開(kāi)腹用 游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，并與彩超結(jié)果進(jìn)行對(duì)照.
2．3病理形態(tài)學(xué)觀察剝離肝臟及其腫瘤，10％ 甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，在光學(xué)顯 微鏡下進(jìn)行組織學(xué)檢查.
結(jié)果
1．彩超檢測(cè)與解剖肉眼觀察結(jié)果正常組小鼠 肝臟彩超檢測(cè)結(jié)果表明：超聲顯示弱回聲，無(wú)結(jié)節(jié)； 正常小鼠解剖肝臟表明：肝臟無(wú)結(jié)節(jié)。模型組小鼠肝 臟超聲與解剖檢測(cè)結(jié)果表明：小鼠原位移植肝癌存 在高回聲、等回聲、低回聲3種類型，其中以高回聲多 見(jiàn)并較易發(fā)現(xiàn)和測(cè)量。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)3d時(shí)，有50％／b鼠 生長(zhǎng)出平均0．2cm×0．14cm大小的結(jié)節(jié)，此ft,寸B超顯 示10只小鼠均無(wú)結(jié)節(jié)；當(dāng)造模第5天時(shí)，有l(wèi)OO％／Jx鼠 長(zhǎng)出平均o．57cmx0．43em大小不等的結(jié)節(jié)或腫塊，并 有1只呈彌漫性生長(zhǎng)，彩超僅檢查出一只實(shí)際大小在 0．29emx0．29em的腫瘤，檢出率占總數(shù)的10％；當(dāng)造 模第9天時(shí)，有100％／1\"鼠長(zhǎng)出平均0．89cmx0．43era， 彩超的檢出率可達(dá)90％；至第16天時(shí)，有100％d、鼠長(zhǎng) 出0．89emx0．66em的腫瘤并且小鼠多伴有腹水，此時(shí) 彩超的檢出率仍為90％。結(jié)果見(jiàn)表l、圖l.
表1 彩超與解剖觀察不問(wèn)時(shí)間小鼠原位移植肝癌情況∞=10) 彩超檢查解剖觀察造模天數(shù)麗面天萬(wàn)可忑夏二了蕊麗看夭不ii忑i再再薄 2．病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果正常組小鼠肝d,nf清晰， 肝細(xì)胞索、肝竇排列整齊，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清楚；肝癌模 型組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，較為彌散，細(xì)胞核體積較 大，深染，多呈圓形或橢圓形，胞漿豐富略嗜堿性， 有的胞漿呈空泡狀，可見(jiàn)病理性核分裂與瘤巨細(xì)胞， 見(jiàn)圖1.
討論
目前，建立小鼠肝癌動(dòng)物模型方法主要有皮下 移植和肝癌的原位移植，而肝癌的原位移植能夠更 好地模仿人肝癌體內(nèi)的血供和生長(zhǎng)環(huán)境，提供與肝 癌病人相似的肝癌生物學(xué)特性，更好地反映抗癌藥 物的藥效學(xué)指標(biāo)。但此種方法要求接種手法準(zhǔn)確， 對(duì)操作環(huán)境要求必須無(wú)菌，尤其此種模型建立是否 成功常采用動(dòng)物處死后評(píng)價(jià)。這是大多數(shù)研究者謹(jǐn) 慎采用此方法的原因之。目前，采用小鼠原位肝癌 移植模型進(jìn)行抗腫瘤藥物研究，缺少行之有效的模 型建立評(píng)價(jià)方法.
彩超是根據(jù)形態(tài)學(xué)的改變?yōu)榕R床診斷疾病提供證據(jù)的，它不像病理那樣作出準(zhǔn)確的診斷，但一些疾 病在超聲顯像中有特殊表現(xiàn)，并且具有活體、實(shí)時(shí)、 動(dòng)態(tài)的優(yōu)點(diǎn)。肝癌的聲像圖有其規(guī)律性，根據(jù)這些變 化的規(guī)律，目前臨床上彩超檢查是常用的診斷方法。上常用的彩超機(jī)對(duì)于實(shí)驗(yàn)有使用方便，容易獲 得的優(yōu)點(diǎn)，因此，本實(shí)驗(yàn)用臨床用彩超機(jī)對(duì)小鼠原位 移植肝腫瘤模型建立進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討用其評(píng)價(jià)小鼠 原位肝腫瘤的可行性.
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：彩超在對(duì)小鼠原位肝癌移植模型 建立的初期(0-5天)評(píng)價(jià)效果并不理想，檢出率僅為 10％，但在腫瘤生長(zhǎng)成熟期(大于0．57era x 0．43era)對(duì) 腫瘤的檢出率有了明顯的提高，檢出率可達(dá)到90％.
臨床用彩超機(jī)在小鼠原位肝癌移植模型的建立過(guò)程 中適用于腫瘤成熟期的評(píng)價(jià).臨床用彩超機(jī)探頭的常用頻率范圍為l一15 MHz，最高頻率為40 MHz，而用于小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的 高頻率超聲系統(tǒng)探頭頻率為12．5—82．5MHz，平均中 心頻率為40 MHz，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)臨床用彩超機(jī)探頭頻 率較低，因此如能夠采用高頻率的探頭將會(huì)提高實(shí) 驗(yàn)的檢出率和準(zhǔn)確度.
對(duì)小鼠原位肝癌移植模型的評(píng)價(jià)采用彩超手段 是一種無(wú)創(chuàng)診斷和監(jiān)澳fl／b鼠肝癌原位腫瘤的可行檢 測(cè)方法，可為中醫(yī)臨床防治肝癌藥物實(shí)驗(yàn)用小鼠肝 癌原位腫瘤模型建立的判斷提供科學(xué)依據(jù)。此檢測(cè) 方法也可用于其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝癌模型建立的評(píng)價(jià).
參考文獻(xiàn)
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