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血凝抑制實(shí)驗(yàn)報(bào)告
隨著社會(huì)一步步向前發(fā)展，報(bào)告的使用成為日常生活的常態(tài)，我們?cè)趯?xiě)報(bào)告的時(shí)候要注意邏輯的合理性。你還在對(duì)寫(xiě)報(bào)告感到一籌莫展嗎？以下是小編精心整理的血凝抑制實(shí)驗(yàn)報(bào)告，僅供參考，希望能夠幫助到大家。
禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)可用于血清中抗體水平的監(jiān)測(cè)，也可用于判斷未使用疫苗群體的感染狀態(tài)等。該試驗(yàn)是目前世界衛(wèi)生組織和國(guó)際動(dòng)物健康組織進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的方法，而且因其具有經(jīng)濟(jì)、快速、可靠、操作簡(jiǎn)便、能夠處理大量的樣品，并能在短時(shí)間內(nèi)報(bào)告禽流感抗體水平等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為當(dāng)前基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室禽流感疫病監(jiān)測(cè)和免疫抗體檢測(cè)中最為常用的方法。但因該試驗(yàn)受人為操作影響較大，經(jīng)常因操作不規(guī)范、不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)仍斐山Y(jié)果偏差大、重復(fù)性差等問(wèn)題，現(xiàn)根據(jù)幾年來(lái)的工作經(jīng)驗(yàn)對(duì)該試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)做一探討。
一、血凝試驗(yàn)操作程序
1、取96孔90°V形酶標(biāo)板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25μLPBS液。
2、吸取25μL標(biāo)準(zhǔn)禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混勻。
3、從第1孔吸取25μL混勻后的抗原液加到第2孔中，混勻后吸取25μL加入到第3孔中，依次進(jìn)行倍比稀釋至第二排最后一孔即第24孔，最后棄去25μL。第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25μL1%的雞紅細(xì)胞懸液。
5、將酶標(biāo)板置于微量振蕩器上振蕩10秒，室溫（20-25℃）靜置30min觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下）。
6、結(jié)果判定：將板作45°傾斜，觀察紅細(xì)胞是否呈淚滴狀流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒稀釋倍數(shù)為1個(gè)血凝單位（HAU）
二、血凝抑制試驗(yàn)操作程序
1、根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4）
2、取96孔V形酶標(biāo)板，用移液器在第1~12孔各加入25μLPBS。
3、在第1孔加入25μL被檢血清，充分混勻后移出25μL加至第2孔，依次類(lèi)推，倍比稀釋至第12孔，棄去25μL。
4、按以上步驟加入陽(yáng)性血清和陰性血清（各做兩份），作對(duì)照孔。
5、在第1~12孔各加入25μL4單位抗原，置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫20-25℃下靜置30min。
6、每孔加入25μL1%的雞紅細(xì)胞懸液。置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫（20-25℃）靜置40min后觀察結(jié)果，若環(huán)境溫度過(guò)高，可于4℃條件下進(jìn)行，紅細(xì)胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。
7、結(jié)果判定：只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于2log2，陽(yáng)性對(duì)照孔誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。將酶標(biāo)板作45°傾斜，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度。當(dāng)被檢血清效價(jià)大于等于4log2，判為禽流感抗體陽(yáng)性。
三、試驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)
1樣品的保存及試驗(yàn)前處理
1.1采集的血液樣品應(yīng)及時(shí)分離血清，分裝至離心管中，標(biāo)記清楚，離心后吸出血清，對(duì)應(yīng)編號(hào)冷藏送檢，并禁止運(yùn)輸過(guò)程中劇烈震動(dòng)。
1.2一般情況下，在5天內(nèi)檢測(cè)的樣品可放置在4℃的冰箱中冷藏，否則低溫冷凍保存。
1.3在檢測(cè)前血清樣品應(yīng)充分混勻，混勻時(shí)采用上下緩慢顛倒幾次的方法即可，切忌劇烈振蕩而引起產(chǎn)生氣泡及血清中蛋白變性。
1.4對(duì)出現(xiàn)膠凍狀的血清樣品，可采用反復(fù)攪動(dòng)幾下再離心的方法有助于緩解該狀態(tài)。膠狀物是含纖維蛋白和纖維蛋白原的血清，可能是由于放置時(shí)間不夠造成的血清未完全析出狀態(tài)。不建議直接吸取其中少量的清亮血清。
1.5水禽等樣品為排除非特異性反應(yīng)，還應(yīng)相應(yīng)進(jìn)行滅能反應(yīng)。具體操作方法：56℃水浴鍋30min或加等量10%雞紅細(xì)胞，輕搖后靜置30分鐘，離心，收集上清液即可。
2器材的選擇
2.1酶標(biāo)板的選擇：
建議使用96孔90°V型板進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)證明：90°V型板相對(duì)于110°板及130°板來(lái)講，具有紅細(xì)胞沉降速度快，產(chǎn)生的凝集圖像清晰、結(jié)果容易判定等優(yōu)點(diǎn)。
2.2移液槍的選擇及使用：
①單道、多道可調(diào)微量移液槍?xiě)?yīng)選擇合適的量程，以便精確度的提高。
�、谑褂脮r(shí)應(yīng)采用一檔吸液二檔排液的方法。吸取液體時(shí)，槍頭要深入液下緩慢平穩(wěn)吸液。加緩沖液時(shí)應(yīng)加在板孔底部。倍比稀釋血清時(shí)，應(yīng)每孔至少反復(fù)吹吸6次，以便混合均勻，還應(yīng)注意盡量避免產(chǎn)生泡沫引起混合不均。加抗原及紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)在板內(nèi)液面上方加樣，以免交叉污染，影響試驗(yàn)結(jié)果。
�、奂訕印⒈侗认♂寱r(shí)應(yīng)高度集中注意力，以免漏加、重復(fù)加樣等。
3試劑的保存及配置
3.1禽流感血凝抑制試驗(yàn)所用的抗原、陽(yáng)性血清應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行保存和配置，試驗(yàn)前應(yīng)提前將其恢復(fù)至室內(nèi)溫�？乖谋４鏈囟葹�-20℃，反復(fù)凍融會(huì)降低抗原的滴度，應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.2PH7.2、0.01mol/L的PBS液的制備。
①應(yīng)盡量現(xiàn)用現(xiàn)配。
�、诿看问褂们皯�(yīng)測(cè)PH值，以免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致PH值發(fā)生改變。
�、塾捎赑H試紙跨度范圍偏大，PH值不易準(zhǔn)確介定，因此采用酸度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)量PH值，以提高試驗(yàn)的精確度。
④全部試驗(yàn)均采用同一種稀釋液。
3.31%紅細(xì)胞的制備。
�、贋楸苊庥行╇u只的紅細(xì)胞有自凝現(xiàn)象，因此配制1%紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)選擇采取2-3只SPF雞或未進(jìn)行過(guò)任何免疫過(guò)的成年公雞血液。當(dāng)然采血的前提條件是要按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如肝素、枸椽酸鈉、檸檬酸鈉等。
�、诓裳戤吅蠓盅b至2ml容量的圓底離心管中，因?yàn)橥ㄟ^(guò)2ml與1.5ml兩種容量離心管相比較，放入1.5ml尖底離心管中的話，離心后，離心管底部紅細(xì)胞不易與加入的PBS液混勻，易沉積在管底部，達(dá)不到洗脫干凈的目的。
�、劢�(jīng)20xx~3000r/min，5~10min，棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過(guò)大使紅細(xì)胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復(fù)幾次直至上清液清亮透明為止。
�、茉诩蛹t細(xì)胞過(guò)程中還須不斷輕搖以確保紅細(xì)胞均勻，使其每孔加入相同數(shù)量的紅細(xì)胞。
⑤制備好的紅細(xì)胞液如果放置后上清液變紅，說(shuō)明有溶血，不可再使用。
3.4抗原液的配制
①先做血凝試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)，以抗原與紅細(xì)胞完全凝集的孔為1HUA抗原，配制4HUA抗原應(yīng)往前推算兩孔，即除以4后的值。
�、诿看巫鲈囼�(yàn)前，必須重新檢測(cè)禽流感抗原的血凝效價(jià)，以免效價(jià)發(fā)生改變而導(dǎo)致抗原稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。
�、蹫楸ＷC配制的抗原準(zhǔn)確，還要進(jìn)行抗原回滴試驗(yàn)。具體方法：做二排抗原回滴，在兩排的第1~8孔各加25微升PBS，取4HAU抗原25微升加在兩排的第1、第2孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第4孔，棄去25微升，另一排同樣。從第2至第8孔補(bǔ)25微升PBS，以保持75微升總量不變，另一排同樣。兩排的第1至第8孔各加25微升1%紅細(xì)胞，震蕩10秒鐘。靜置30分鐘觀察結(jié)果。這樣在第1孔為4HAU抗原，第2孔為2HAU抗原，第3孔為1HAU抗原，第4孔為1/2HAU抗原，均為75微升總量，第5至第8孔為空白對(duì)照。如果抗原回滴試驗(yàn)不成立，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整抗原濃度直至回滴試驗(yàn)成立。因?yàn)槿绻乖瓭舛冗^(guò)高，則所測(cè)定的抗體效價(jià)水平偏低，如果抗原濃度過(guò)低，則所測(cè)定的效價(jià)偏高。所以不調(diào)整抗原濃度至實(shí)驗(yàn)成立的話會(huì)對(duì)結(jié)果有很大影響。
4結(jié)果的判定
每次試驗(yàn)必須設(shè)陽(yáng)性及陰性（空白）對(duì)照血清，判別試驗(yàn)是否成立。判讀結(jié)果時(shí)，將酶標(biāo)板傾斜45°，以孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無(wú)凝集顆粒為凝集完全抑制。
5試驗(yàn)器具的清洗
每次試驗(yàn)完畢后，應(yīng)將酶標(biāo)板中液體甩凈，然后用自來(lái)水反復(fù)沖凈每個(gè)孔，再放入3%NaOH中4小時(shí)，清水反復(fù)沖凈，再放入3%Hcl中4小時(shí)，清水反復(fù)沖凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗幾次，甩干水份，入干燥箱中干燥備用。實(shí)驗(yàn)用燒杯、加樣槽、量筒等也應(yīng)充分洗凈、干燥。以免器具內(nèi)有雜物、污物以及殘留物從而影響試驗(yàn)結(jié)果。
四、小結(jié)
在進(jìn)行禽流感血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)充分考慮到各方面的影響因素，提供的檢測(cè)結(jié)果才會(huì)真實(shí)可靠，準(zhǔn)確掌握禽類(lèi)的免疫抗體水平，進(jìn)而為科學(xué)防控禽流感提供理論依據(jù)。
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