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重組逆轉(zhuǎn)錄病毒雙表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)K562細(xì)胞增殖活性的影響
目的 構(gòu)建針對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的雙表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,初步探討其對(duì)K562細(xì)胞表型的影響.方法 以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-neo為骨架,構(gòu)建eGFP及針對(duì)bcr-abl b3a2型mRNA的反義RNA雙表達(dá)載體pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同時(shí)構(gòu)建對(duì)照載體pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及測(cè)序鑒定各重組載體;以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染各載體到PT67包裝細(xì)胞后,G418篩選穩(wěn)定的病毒產(chǎn)生細(xì)胞株,再以NIH3T3細(xì)胞測(cè)定病毒滴度并感染K562細(xì)胞,計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、并用Western blot檢測(cè)PKR激活情況.結(jié)果 酶切及測(cè)序結(jié)果證實(shí)各重組載體構(gòu)建完全正確;G418篩選到高滴度重組逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染組K562細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制,其24 h時(shí)早期細(xì)胞凋亡率為22.54±3.19%,與除PT67-80as組外的其余各組相比有顯著差異(P＜0.05);PT67-40as和PT67-80as處理組細(xì)胞PKR磷酸化水平分別增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用.結(jié)論 成功構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒雙表達(dá)載體,并發(fā)現(xiàn)其能抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)并引起細(xì)胞凋亡,通過(guò)激活PKR抗腫瘤可望成為腫瘤新的靶向治療策略.
作 者： 曾建明 馮文莉 王小中 趙世巧 白衛(wèi)君 羅云萍 溫健萍 涂植光 黃宗干 ZENG Jian-ming FENG Wen-li WANG Xiao-zhong ZHAO Shi-qiao BAI Wei-jun LUO Yun-ping WEN Jian-ping TU Zhi-guang HUANG Zong-gan 作者單位： 曾建明,馮文莉,王小中,趙世巧,白衛(wèi)君,羅云萍,ZENG Jian-ming,FENG Wen-li,WANG Xiao-zhong,ZHAO Shi-qiao,BAI Wei-jun,LUO Yun-ping(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床血液學(xué)教研室,臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400016)溫健萍,WEN Jian-ping(Canadian Blood Services,Hamilton,ON L8S 1H8 Canada)
涂植光,TU Zhi-guang(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床生物化學(xué)教研室,重慶,400016)
黃宗干,HUANG Zong-gan(重慶醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院血液科,重慶,400016)
刊 名： 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào) ISTIC PKU 英文刊名： ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE 年，卷(期)： 2006 28(21) 分類號(hào)： Q782 R329.28 R733.722 關(guān)鍵詞： 慢性粒細(xì)胞白血病 PKR 反義RNA 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 基因克隆【重組逆轉(zhuǎn)錄病毒雙表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)K562細(xì)胞增殖活性的影響】相關(guān)文章：
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